Membrane protein characterization in microvesicles

 

 

 

Caractérisation des protéines membranaires en microvésicules

 

 

Contexte : Les PMs sont codées par un tiers des gènes humains1 et jouent des rôles cruciaux dans la plupart des processus biologiques (e.g. transport d’ions et de molécules, contrôle du potentiel transmembranaire, génération et transduction d’énergie, reconnaissance et transduction du signal, catalyse de réactions chimiques). C’est pourquoi elles sont les cibles majeures des médicaments validés mais aussi des découvertes actuelles et futures2. Il y a donc un intérêt croissant à leur étude in vitro mais leurs études fonctionnelles et structurales sont limitées à cause de leurs propriétés physicochimiques (hydrophobicité), leur faible abondance dans les membranes natives, et les difficultés rencontrées à les exprimer dans des systèmes classiques (toxicité, faible taux d’expression, mauvais repliement) et à les reconstituer en protéoliposomes.

 

Solutions, limitations et challenges actuels : Divers systèmes d’expression ont été développés afin d’obtenir suffisamment de matériel fonctionnellement actif mais ils ont des avantages et des inconvénients3. Parmi eux, les systèmes d’expression bactériens représentent les premiers essais car ils sont faciles à manipuler, peu coûteux, donnent des rendements meilleurs et un changement d’échelle facilité vers la production en grand volume. Deux systèmes complémentaires peuvent être testés en parallèle: le système le plus vieux et le plus exploité, Escherichia coli, et Lactococcus lactis; quelques études les combinent déjà avec une caractérisation fonctionnelle dans L. lactis et une analyse structurale avec E. coli4. L. lactis a émergé dans la dernière décennie et a fait ses preuves comme alternative à E. coli5. Environ une centaine de PMs de diverses origines, topologies et fonctions ont été exprimées dans L. lactis avec le système NICE (Expression de gène contrôlé par la nisine) et parmi eux, quelques protéines humaines6,7. Trois structures 3D de PMs procaryotes ont été récemment publiées (jusqu’à 53 kDa et 11 hélices α). L. lactis présente plusieurs avantages sur E. coli: i) une expression facilitée de PMs (difficiles); ii) l’absence de formation de corps d’inclusion; iii) seulement une membrane riche en glycolipide ; iv) pas d’endotoxines et une activité protéase faible; et, v) plus intéressant, la bactérie lactique est de qualité alimentaire (utilisée pour la production d’aliments fermentés), i.e. « generally regarded as safe » 8-9(GRAS).


Aujourd’hui, en fonction de la nature de la protéine, divers tests fonctionnels basés sur des techniques chimiques, biochimiques et biophysiques peuvent être réalisés sur différents matériels biologiques tels que les cellules intactes, les fractions membranaires, les protéoliposomes (après solubilisation avec des détergents et purification) ou des PMs purifiées. Néanmoins, la plupart requière du marquage, des grandes quantités de protéines et/ou sont effectuées sur des reconstitutions rudimentaires de PMs en environnement lipidique.
Développer des nouvelles techniques biophysiques sans marquage compatible avec la présence de lipide dans les échantillons pour des études fonctionnelles et avec des petites quantités de protéines reste un challenge pour les personnes travaillant avec les protéines membranaires.

 

Contribution de notre groupe dans ce domaine : Une plateforme sans marquage de nanobiocaractérisation de microparticules sanguines a récemment été développée dans notre groupe basé sur la combinaison de Résonance Plasmonique de Surface (SPR), la Microscopie à Force Atomique (AFM)10 et la spectrométrie de masse. La SPR détecte et quantifie les interactions moléculaires en temps réel sur une surface, même dans un milieu complexe11-12. La microscopie à force atomique permet des caractérisations plus profondes en taille et en forme13-15. De plus, la spectrométrie de masse effectuée sur la biopuce après capture spécifique est le moyen d’obtenir les signatures protéiques des échantillons dans différentes conditions (profilage protéomique, voie de signalisation cellulaire…). Ce couplage “SPR/AFM/MS” permet de corréler les mesures moyennes de l’activité biologique à l’échelle macro sur la biopuce et la visualisation in situ à l’échelle nano d’évènements biologiques et de signatures protéiques. Cette plateforme va être adaptée à la caractérisation de PMs dans des microvésicules bactériennes et complétera d’un point de vue nanophysique le panel des techniques disponibles pour leurs études fonctionnelles en environnement lipidique.

 

Mots-Clés : Surface Plasmon Resonance, Atomic Force Microscopy, Mass Spectrometry

 

Supports financiers et techniques : Région Franche-Comté (Project Emergence/Excellence) (2016), MIMENTO and CLIPP Platforms.

 

Contacts: A. Frelet-Barrand, C. Elie-Caille, W. Boireau

 

Références:

1.    Wallin E. and Von Heijne G (1998) Protein Sci. 7:1029-38.
2.    Rucevic M. et al. (2011) Electrophoresis 32:1549-64.
3.    Junge F. et al. (2008) Cell Mol Life Sci. 65:1729-55.
4.    Seeger M.A. et al. (2012) PLoS One 7:e37845.
5.    Bernaudat F., Frelet-Barrand A et al. (2011) PLoS One 6: e29191
6.    Bakari S., …Frelet-Barrand A (2014) Chapter 5 “Membrane Proteins Production for Structural Analysis” (ed. I. Mus-Vuteau; Springer eBook) p107-132.
7.    Bakari S, …. Frelet-Barrand A (2016). Mol Biotechnol. 58:299-310. doi: 10.1007/s12033-016-9928-z.
8.    Kunji E.R. et al. (2003) Biochim Biophys Acta 1610:97-108
9.    Mierau I. et al. (2005) Microb Cell Fact. 4:16.
10.    Obeid S. et al. (2016) Bioelectron. pii: S0956-5663(16)30856-9. doi: 10.1016/j.bios.2016.08.100.
11.    Remy-Martin F. et al, (2012) Anal. Bioanal. Chem. 404(2), 423-432
12.    Rouleau A. et al (2012), Sensors, 12(11), 15119-1513
13.    Ewald M. et al (2015), Nanotechnology, 25(29) 295101
14.    Heu C. et al (2012), J. Struct Biol, 178(1), 1-7
15.    Berthier A. et al (2011) J. Molec. Recogn. 24(3),429-435